核酸檢測的一場革命，可替代PCR的犀利技術

發布: 2014-10-31 12:58    作者: webmaster    來源: 生物通 

自PCR技術誕生以來已經有三十年了。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。

英國TwistDx Inc公司開發的重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。以此為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物防御、農業等領域。

RPA技術犀利在何處

常規PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的最適溫度在37°C - 42°C之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現便攜式的快速核酸檢測。

據介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產物進行終點檢測，還可以對擴增過程進行實時監控，甚至可以通過試紙條（側流層析試紙條LFD）讀取結果。

目前，TwistAmp? 試劑盒的擴增子長度在500bp以內。不過，經過特別優化的RPA擴增，也可以生成更長的擴增產物，或者減慢擴增速度（便于定量），甚至在更低的溫度下進行反應。

RPA技術的基本原理

RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37°C左右。

ViaFect轉染試劑

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非?？?，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。

RPA擴增的基礎體系（TwistAmp? Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要準備好引物和模板就行。擴增結果可以通過凝膠電泳進行終點檢測，產物純化后可用于下游研究。

在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，就可以實現多樣化的RPA應用。舉例來說，TwistAmp? Basic RT添加了逆轉錄酶，可以對RNA模板進行一步法擴增。

TwistAmp? exo結合了專利的exo探針技術和核酸外切酶III，能實現數據的實時讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應終點的擴增子總量有所減少，適合獲得強熒光信號進行動力學分析，不適合終點檢測（比如跑膠）。將exo探針技術、核酸外切酶III和逆轉錄酶結合起來的TwistAmp? exo RT，可以一步實現RNA模板的實時擴增。

TwistAmp? fpg是一個添加了核酶fpg的實時報告體系。fpg探針技術的熒光累積比較慢，但終點的擴增子產量不會減少，因此也能支持終點分析。TwistAmp? nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”進行終點檢測，比如測流層析試紙條LFD。

除此之外，RPA擴增還可以很簡單的實現多重化。只需要增加引物/探針就可以一次性檢測多個擴增產物。

RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-38個堿基。引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。

在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進行優化。雖然還沒有設計軟件可以使用，不過TwistDx Inc公司在自己的網站上提供了相應的篩選指南。

需要注意的是，目前的TwistAmp? 擴增試劑盒都沒提供RNase抑制劑。另外，受目前的生產方法所限，RPA反應不適合用于E. coli標準實驗室菌株的擴增。(生物谷Bioon.com)